Vattenprov, lyserade celler eller homogeniserad vävnad blandas med lika stora volymer av en blandning av fenol och kloroform. Denna blandning centrifugeras sedan. Eftersom fenol:kloroform-blandningen inte är blandbar med vatten kommer centrifugen att leda till att två olika faser bildas: en övre vattenfas och en nedre organisk fas. Den vattenhaltiga fasen stiger upp till toppen eftersom den är mindre tät än den organiska fasen som innehåller fenolkloroformblandningen. Denna skillnad i densitet är anledningen till att fenol, som bara har en något högre densitet än vatten, måste blandas med kloroform för att bilda en blandning med en mycket högre densitet än vatten.
De hydrofoba lipiderna kommer att fördelas i den nedre organiska fasen, och proteinerna kommer att stanna kvar i interfasen mellan de två faserna, medan nukleinsyrorna (liksom andra föroreningar som salter, sockerarter etc.) stannar kvar i den övre vattenfasen. Den övre vattenfasen kan sedan pipetteras bort. Man måste vara försiktig så att man undviker att pipettera något av den organiska fasen eller material vid gränssnittet. Detta förfarande utförs ofta flera gånger för att öka DNA:s renhet. Detta förfarande ger stort dubbelsträngat DNA som kan användas i PCR eller RFLP.
Om blandningen är sur kommer DNA att fällas ut i den organiska fasen medan RNA förblir i den vattenhaltiga fasen. Detta beror på att DNA neutraliseras lättare än RNA.
Det finns vissa nackdelar med denna teknik vid kriminalteknisk användning. Den är tidskrävande och använder farliga reagenser. Eftersom det är en process i två steg som innebär överföring av reagenser mellan olika rör, är risken för kontaminering också större.